甘菊3个ClSCL6基因的克隆及表达分析

GRAS家族HAM亚家族基因是维持植物茎端分生组织(shoot apical meristem,SAM)未分化状态的重要因子,并影响着植物的成花转化进程。该研究基于转录组数据中甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)HAM亚家族基因同源序列设计引物,利用RT PCR技术从甘菊中克隆得到3个HAM类基因。序列分析结果表明,所克隆的3个基因开放阅读框长度分别为1 845、1 479和1 881 bp,分别编码614、492和626个氨基酸。Blastp分析显示,3个基因的编码蛋白均含有典型HAM亚家族蛋白特征,并与菊科植物黄花蒿(Artemisia annua)SCL6蛋白具有较高的一致性,分别达到了94.39%、91.90%和94.27%。进一步分析表明,3个基因的编码蛋白与所有拟南芥GRAS家族中的SCL6蛋白进化关系最近,故将其分别命名为ClSCL6a、ClSCL6b和ClSCL6c。荧光定量分析显示,3个ClSCL6基因均在甘菊茎中表达量最高,而在根和花中表达量普遍较低。在不同发育时期的花器官中,3个ClSCL6基因均有表达,其中ClSCL6a在管状花花粉散开前达到表达高峰,ClSCL6b和ClSCL6c则在小花蕾时期表达量最高,在其他时期表达水平差异不大。该研究结果为进一步研究ClSCL6在菊花成花转化过程中的功能奠定了基础。     

乳酸菌食品级表达载体的研究与应用

乳酸菌是能够发酵糖类产生大量有机酸的革兰氏阳性菌的通称,在发酵食品中有着悠久的应用历史。乳酸菌通常被认为是安全菌株,这些微生物的基因工程操作在食品、医学等方面具有广阔的应用前景。表达载体是基因工程中常用的工具之一,大多数乳酸菌的表达载体通常以抗生素抗性基因作为选择标记,然而抗性基因具有潜在的转移性,因此需要开发食品级表达载体。食品级表达载体不含有抗生素的抗性基因,仅包含来自同源宿主或通常被认为是安全生物的DNA。本文介绍了乳酸菌食品级表达载体的构成及其常用宿主,同时对乳酸菌食品级表达载体的应用进行了归纳总结。     

敲减神经肽F基因(npf)对亚洲玉米螟取食、生长发育和繁殖的影响

【目的】神经肽F(neuropeptide F, NPF)是无脊椎动物特有的一类神经肽,因其C末端是苯丙氨酸(F)而命名,参与昆虫的取食、生物节律、学习记忆等多种生理功能的调控。本研究旨在明确NPF对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis生长发育的影响,为害虫防治提供重要依据。【方法】采用一种基于工程菌高效合成靶向昆虫基因的dsRNA的方法经济有效地敲降npf,用低浓度(0.01%)和高浓度(0.02%)dsNPF和dsGFP(对照)分别饲喂亚洲玉米螟1龄初、3龄初和5龄初幼虫直至化蛹,检测5龄幼虫平均取食量、体重、体长、存活率和化蛹率,蛹羽化率和成虫产卵量,以及幼虫各龄期、蛹发育历期和成虫寿命。【结果】从亚洲玉米螟1, 3和5龄初幼虫开始饲喂0.01%和0.02% dsNPF时,与饲喂相应浓度dsGFP的对照相比,除个别点外,5龄幼虫的取食量、体重、体长、存活率和化蛹率,蛹羽化率和成虫单雌产卵量均显著降低,幼虫各龄期、蛹发育历期均显著延长,成虫寿命显著缩短。且dsNPF处理幼虫的龄期越早对发育的影响越大。其中0.01% dsNPF处理的1龄幼虫和0.02% dsNPF处理的3龄幼虫有90%的个体在蛹期死亡,而0.02%dsNPF处理的1龄幼虫有90%的个体在幼虫期死亡。【结论】结果提示NPF对亚洲玉米螟的发育和取食具有调控作用,这为探索新型绿色的害虫防治提供了依据。     

亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂工蜂嗅觉学习行为的影响及其脑部转录组分析

【目的】分析吡虫啉处理对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica嗅觉学习行为及脑部基因转录的影响,为新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的负面影响提供依据。【方法】实验室条件下一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含有4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液,以饲喂不含吡虫啉的50%蔗糖溶液为对照,通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)行为实验测定其对意大利蜜蜂成年工蜂嗅觉学习行为的影响;收集上述测试的意大利蜜蜂工蜂脑部提取RNA,进行RNA-Seq测序和生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR挑选6个差异表达基因(DEGs)检测其在脑部的表达量以验证RNA-Seq测序结果。【结果】一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液后,意大利蜜蜂的嗅觉学习能力与对照组(饲喂50%蔗糖溶液)相比显著降低。RNA-Seq测序结果显示饲喂意大利蜜蜂含4 ng吡虫啉蔗糖溶液后,处理组与对照组之间共有123个DEGs［校正后的P值(padj)<0.05)］,包括82个下调DEGs和41个上调DEGs。GO聚类分析发现下调DEGs主要富集在S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性、酸性磷酸酶活性、氧化还原酶活性、蛋白质异二聚化活性等,上调DEGs主要富集在跨膜受体活性、分子传感器活性、神经学系统过程等功能条目。KEGG富集分析显示下调DEGs主要富集在核糖体和溶酶体等细胞器、碳代谢和色氨酸代谢等代谢通路及Toll和Imd信号通路,上调DEGs未富集在KEGG代谢通路。荧光定量PCR结果显示测试的6个DEGs相对表达量变化趋势与RNA-Seq测序结果FPKM(fragments per kilobase million)值变化趋势一致,证明RNA-Seq测序结果可靠。【结论】亚致死剂量吡虫啉胁迫意大利蜜蜂成年工蜂显著降低意大利蜜蜂的嗅觉学习能力,影响意大利蜜蜂脑部免疫解毒等相关基因的表达和酶活性及氧化还原等生物代谢过程;亚致死剂量吡虫啉短时胁迫会刺激意大利蜜蜂的嗅觉感觉过程及神经信号传导过程。     

草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

【目的】本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的功能奠定基础。【方法】运用RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾SfTPS的全长编码区,并进行生物信息学分析。运用RT-qPCR技术检测SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(体壁、中肠和脂肪体)中和经短期(2, 4和8 h)高(35℃)低温(10℃)胁迫后5龄幼虫中的表达变化。【结果】克隆获得2 571 bp的草地贪夜蛾TPS cDNA序列,命名为SfTPS(GenBank登录号： MT920672),全长开放阅读框(ORF)长2 481 bp,编码的826个氨基酸具有TPS和TPP两个保守结构域。同源比对和系统进化分析表明,昆虫TPS蛋白具有较高的保守性,SfTPS与斜纹夜蛾S. litura的TPS亲缘关系最近,序列一致性达到99.15%。SfTPS中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲占比分别为38.14%, 12.23%和48.55%;SfTPS的三级结构为同源二聚体。RT-qPCR结果表明,SfTPS在草地贪夜蛾卵期和1-5龄幼虫期低表达,在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达,且草地贪夜蛾变态前后SfTPS的表达量变化较大。组织分布结果显示,SfTPS在5龄幼虫脂肪体中表达量最高。草地贪夜蛾5龄幼虫经2~8 h低温(10℃)和高温(35℃)胁迫后,SfTPS的相对表达量显著高于对照(25℃),分别为对照的4.43~9.34和2.50~6.03倍。【结论】SfTPS基因在草地贪夜蛾生长发育过程及抵御高低温度胁迫中可能具有重要作用。     

柞蚕微粒子病潜在生物标志物的挖掘

【目的】挖掘柞蚕Antheraea pernyi微粒子病的潜在生物标志物,为开发该病害检测方法及研究柞蚕被微孢子虫Nosema pernyi侵染后体内代谢产物的差异及功能奠定基础。【方法】利用高效液相色谱和高分辨率质谱进行非靶向代谢组学分析,调查健康和患微粒子病柞蚕雌成虫血淋巴中代谢物差异。【结果】正离子模式下从健康和患微粒子病柞蚕雌成虫血淋巴中共获得8 870个代谢物,注释代谢物5 390个,筛选到差异表达代谢物472个(上调260个,下调212个),其中二级鉴定差异表达代谢物12个(上调8个,下调4个);负离子模式下获得6 716个代谢物,注释代谢物3 848个,筛选到差异表达代谢物301个(上调207个,下调94个),其中二级鉴定差异表达代谢物9个(上调8个,下调1个)。正离子模式下二级鉴定的差异表达代谢物包括缬氨酸(valine)、苯并噻唑(benzothiazole)、3-脱羟基肉碱(3-dehydroxycarnitine)、1 甲基鸟嘌呤(1-methylguanine)、2-乙氧基萘(2-ethoxynaphthalene)、N6-乙酰基-L-赖氨酸(N6-acetyl-L-lysine)、生物素(biotin)、桑色素(morin)、噻吗洛尔(timolol)、酰基肉碱15∶0(acylcarnitine 15∶0)、酰基肉碱18∶4(acylcarnitine 18∶4)和异槲皮苷(isoquercitrin);负离子模式下二级鉴定的差异表达代谢物包括二甲基丙二酸(dimethylmalonic acid)、戊二酸(glutaric acid)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)、1,3-二乙酰基丙烷(1,3-diacetylpropane)、3-(4-羟基苯基)乳酸(DL-p-hydroxyphenyllactic acid)、泛酸(pantothenate)、荧光素(fluorescein)、飞燕草素-3-O-beta-吡喃葡萄糖苷(delphinidin-3-O-beta-glucopyranoside)和溶血磷酯酰肌醇16∶1 (lysoPI 16∶1)。【结论】健康与患柞蚕微粒子病的柞蚕雌成虫血淋巴内代谢物具有显著差异,通过代谢组学挖掘出21个二级鉴定的差异表达代谢物,这些代谢物可作为潜在生物标志物用于开发柞蚕微粒子病的检测方法。     

弗里熊蜂蜜罐中糖液成分分析

【目的】熊蜂是众多植物的重要传粉昆虫,以采集并贮藏花蜜和花粉为主要食物。本研究旨在探究熊蜂的营养需求及明确其对采集的食物是否存在酿制过程。【方法】利用白砂糖溶液(糖浓度50%)饲喂弗里熊蜂Bombus friseanus蜂群,收集并检测其贮藏在蜜罐中1~7 d的糖液,作为处理组样品;同时将上述白砂糖溶液置于灭菌离心管中,排除熊蜂取食,作为对照组样品,测定贮藏期间处理组和对照组糖液的pH值、糖浓度、糖组分及α-淀粉酶和转化酶活性。【结果】弗里熊蜂B. friseanus贮藏在蜜中1~7d的糖液pH值平均为3.74±0.13,显著低于对照组(6.55±0.15);糖浓度与贮藏时间显著正相关,贮藏6d后糖浓度显著高于贮藏1~3 d时的;糖液组分更加丰富,除蔗糖外利用HPLC还检出果糖、葡萄糖、麦芽糖和海藻糖,贮藏4~5 d的糖液中己糖含量极显著高于贮藏1~3 d和6~7 d时的,己糖和麦芽糖含量分别与蔗糖含量极显著负相关,总糖中果糖和麦芽糖含量与贮藏时间极显著负相关,葡萄糖、蔗糖和海藻糖的含量分别与贮藏时间极显著正相关。贮藏6 d的糖液中α-淀粉酶活性显著高于其他时间,其他贮藏时间样品间α-淀粉酶活性差异不显著,而所有样本的转化酶活性在21.17~38.05 U/g FW之间,随贮藏时间的延长差异不显著。【结论】弗里熊蜂B. friseanus采集人工饲喂的糖溶液贮藏在蜜罐中,经其加工后发生了物理和生物化学变化,揭示熊蜂存在酿蜜能力。本研究的结果为熊蜂生物学及繁育研究提供了参考。     

基于多源数据的黄土高原陆地水循环结构变化分析

近几十年间,黄土高原的水循环进程在人类活动与气候变化的影响下已产生了剧烈的变化。为加深对水循环结构变化的了解与认识,利用1982-2010年的降水、蒸散发、径流、土壤储水量和社会经济用水等数据,运用Mann-Kendall趋势检验和线性回归分析方法,对黄土高原的水量平衡进行评估,且细化了组成水循环的12种水文变量,并分析了水循环各分量的变化趋势及其结构的演化规律。由于网格化的社会经济用水数据（1982-2010年）对本研究产生了较大的时间限制,因此本文注重于探究这29年间黄土高原各水文变量的变化趋势及水循环结构的演化规律。结果表明：在自然系统中,蒸散发以1.97 mm/a的速率上升（P<0.01）,径流、降水和土壤储水量分别以1.01 mm/a（P<0.01）、0.77 mm/a和0.46 mm/a的速率下降。在社会系统中,社会经济用水以0.50 mm/a的速率上升,其中主要由于生活、制造业、发电和采矿用水分别以0.22、0.23、0.30 mm/a和0.01 mm/a的速率增加所导致。此外,灌溉和牲畜用水分别以0.25 mm/a（P<0.05）、0.01 mm/a（P<0.01）的速率减少。就水循环结构而言,多年平均蒸散发和社会经济用水占水循环的平均比例分别为80.95%、15.27%,并以每年0.16%、0.06%的速率逐渐升高。径流、土壤储水量的变化占水循环的平均比例分别为4.00%、-0.24%,并以每年0.24%（P<0.01）、0.02%的速率逐渐下降。随着社会经济的发展和人口的增加,区域水资源供需矛盾将进一步加剧,本研究对黄土高原水资源的科学调控与可持续利用有重要参考意义。     

会仙岩溶湿地4种覆被下土壤酶活性和微生物生物量

研究湿地系统中的稻田被撂荒以后土壤酶活性和微生物生物量的变化可以为湿地的保护提供参考依据。以桂林会仙岩溶湿地为研究样地,采集芦苇湿地、华科拉莎草湿地、稻田撂荒地（以双穗雀稗和莲子草为优势植被）和稻田的耕层土壤样品,采用比色法和氯仿熏蒸法分别检测土壤酶活性和微生物生物量。结果表明,稻田撂荒地的土壤微生物生物量碳（MBC）为（345.20±30.06） mg/kg,显著低于其它三种覆被下的土壤;微生物生物量氮（MBN）、微生物DNA、蔗糖酶活性和碱性磷酸酶活性分别为（48.03±18.48） mg/kg、（5.65±1.48）μg/kg、（19.16±1.43） mg g^-1（24h）^-1和（2.20±0.94） mg g^-1（24h）^-1,均显著低于稻田,而与两种天然湿地没有显著差异。主成分分析表明,稻田撂荒地能与稻田明显分开,而与其它两种覆被土壤有所交叉。统计分析表明,MBC和碱性磷酸酶活性均与pH呈显著正相关关系（P<0.05）;MBN、蔗糖酶活性和碱性磷酸酶活性均与土壤总有机碳（SOC）呈显著的正相关关系（P<0.05）;土壤微生物DNA与SOC、总氮（TN）和碱解氮（AN）均呈显著正相关关系（P<0.01）,与Mg²⁺呈显著正相关关系（P<0.05）。以上研究结果表明,会仙湿地中的稻田在撂荒以后,土壤微生物生物量和两种土壤酶活性显著降低,影响微生物生物量和土壤酶活性变化的主要因素是pH、SOC、TN、AN和Mg²⁺。因此,建议在稻田撂荒地上重新种植水稻,以加快会仙岩溶湿地的恢复过程。     

老爷岭南部狍冬季移动、卧息生境选择及其适宜性评价

在动物生境研究中,移动生境和卧息生境是生境研究的焦点。开展移动生境和卧息生境选择,并在此基础上进行生境评价,有利于深入了解动物对移动和卧息生境条件的需求,制定科学合理的栖息地保护计划。以东北虎（Panthera tigris altaica）的主要猎物物种之一-狍（Capreolus pygargus）为研究对象,于2017-2019年冬季积雪覆盖期在老爷岭南部通过随机布设28个大样方和84条用于足迹链跟踪的样线收集狍的移动点和卧息点信息,再结合近年来收集的东北虎出现点,利用广义可加模型（GAM）和最大熵模型（MaxEnt）进行狍移动、卧息生境选择及评价研究。移动生境选择研究表明,狍在移动的过程中偏好选择坡度小、距农田距离>500 m、远离道路、居民点和低海拔或较高海拔的区域;移动生境评价分析表明,移动适宜和次适宜生境面积之和为1318.16 km²,占研究区域面积的51.28%,当加入虎活动点影响因子后,狍移动适宜和次适宜生境面积之和为901.52 km²,适宜和次适宜生境面积之和减少了31.61%。狍卧息生境选择研究表明,水源、农田、道路和雪深是影响狍卧息的关键因素,其中雪深对狍卧息生境选择的贡献率达到70.13%;卧息生境评价表明,卧息适宜和次适宜生境面积之和为1243.77 km²,占研究区域面积的48.39%,当加入虎出现点因子后,适宜生境和次适宜生境面积之和减少了61.00%,仅为485.02 km²。研究认为,虎的出现对狍移动和卧息生境选择均产生影响,虎的活动及捕食行为可能会减少狍的活动范围和频次,狍远离虎活动区域卧息休息,压缩了狍适宜卧息的空间。